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离体心脏泵功能的测量方法
 

                                  余志斌

    为了排除神经-体液等因素对心脏泵功能的影响,精确观测冠脉系统的作用,建立定量化的心脏缺血/再灌注研究模型,离体灌流心脏则是较好的选择。迄今为止有两种离体心脏模型来监测心脏固有的泵功能:Langendorff模型与工作心脏(Working heart)模型。根据以往的研究报道,用于进行离体心脏灌流的大型哺乳动物涉及猪、狗、羊、猴,甚至人。小型哺乳动物有兔、豚鼠、田鼠、仓鼠、雪貂、沙鼠(gerbil)和小鼠。另外还有青蛙与鸟类等非哺乳动物。使用大型哺乳动物离体心脏的主要弊端是动物费用高,参数变异较大,需大容量的灌流液与大型的仪器设备。随着与心血管系统相关的转基因小鼠的大量涌现,小鼠离体心脏灌流模型将越来越多地被使用,然而,小鼠离体心脏灌流模型的特征尚未探明(如压力-容积关系,钙-功能关系等),操作与心室内压测量比较困难。小鼠心率快,既要注意由此带来的物理学方面改变,还要注意在使用小型测量仪器时,仪器的频率响应是否能满足要求。

    大鼠离体心脏灌流模型是迄今使用最多,基本特征也是比较明了的一个模型,该模型容易操作,且可建立许多复杂的模型,如Working heart与血液灌流模型。但是,因大鼠心肌细胞动作电位时程短,缺乏明显的平台期,故其心律失常模型与抗心律失常药物作用效应的研究结果,过渡到人的应用存在一定的限制。兔的心脏收缩功能对麻醉药物非常敏感。豚鼠冠脉侧支循环丰富,结扎冠状动脉分支不能建立局部缺血模型。因此,没有完全理想的动物模型,在应用时,要知道动物种属间的差异,尽可能地避开不利因素,充分发挥其优势。

     使用离体心脏灌流,具有的明显优势有:1)可大量重复,成本低廉;2)可进行生化、生理、药理与形态等多方面的观测;3)不受神经-体液因素、肺与体循环因素、以及其它器官的影响。还可在体外模拟这些因素,进行精确的定量调控研究;4)可建立全心或局部缺血/再灌注模型,可以调节供氧的程度;5)可记录电生理信号,并建立心律失常模型。在较大动物心脏,还能描绘心传导系统的走向图;6)在模拟疾病后,仍能继续观测,以便探索这些疾病的后期影响。如缺血引起心功能降低,心律失常或停搏,这些在活体中发生后,实验即告终止,然而在离体心脏还可继续进行实验观测。

     形态与血管解剖观测:灌流的心脏可随时采集标本,进行光镜与电镜的观测。利用主动脉灌流,可方便的进行全心灌流固定;也可以在正常灌流观测功能变化的不同时期,从心尖到心底部剪取小组织块,进行固定。还可方便地观测心肌梗死面积的大小。用不同的凝胶、微粒与树脂经冠脉灌注后,可对冠脉血管床进行可视化研究。

     生化研究:通过分析动/静脉流入与流出中乳酸、氧或其他分子标记的差别,监测心脏代谢与底物的变化。分析流出液中心肌细胞内特有酶与蛋白的含量,可了解心肌的损伤程度。也可直接取心肌标本进行代谢分析。灌流心脏可进行核磁共振(NMR)谱扫描,实时分析代谢产物、细胞内离子如Ca2+、H+与Na+等的动态变化。使用跨壁或表面反射荧光光谱法可动态监测NADH或钙离子的变化。吸附式微电极可动态监测组织间隙K+、Ca2+、pH与单相动作电位的变化。灌流心脏也是观测基因转染质粒选择性运输与吸附的较好模型,可观测腺病毒或其他病毒在冠脉内选择性传输与吸附。

    心律与电生理研究:ECG可记录、监测与定量分析心律失常。在兔与猪等较大心脏上,可用微电极描绘出电传到通路图,并进行选择性电消融试验。

    心收缩功能:Langendorff制备可监测左心室收缩与舒张压参数,以及它们的衍生参数。工作心脏制备可提供泵功能的数据。许多张力测量仪器也可放置的心脏表面进行监测。超声晶体可用来观测心室容积与室壁厚度的变化。依压力-容积关系可推算出Emax,这是反映心收缩性能的较好指标[1]

    药理学研究:两种模式在研究心血管疾病治疗药物中均非常有价值,特别是收缩功能、调节电活动与代谢药物的研究。可采用循环或非循环灌流的方法,监测药物的剂量-效应关系,重复性好,药物浓度可精确控制。另一优点是可迅速洗脱药物的作用。

    血管生物学研究:当大量研究使用这两种模式观测心肌细胞的生理与病理功能时,在收缩与代谢功能的最大值条件下,可应用这两种模式观测血管反应性、内皮与平滑肌功能,以及多种干预对冠脉血流量与分布的作用。在缺血/再灌注研究中,发生缺血的一些区域不能恢复血流再灌注,离体心脏模型则成为大量开展研究这一现象的基石[2]

一、Langendorff制备

     1895年Oscar Langendorff首次报道用哺育动物离体心脏进行心脏泵功能研究,故称为Langendorff模型[3]。1898年,Porter[4]首先此模型用于冠状动脉循环的研究,此后,各种改良的Langendorff模型广泛地应用于生理学和药理学的实验研究,如Gottlieb[5]用球囊装置测量离体心脏左心室容量变化;Heymann[6]用另一动物心脏提供氧合血液来灌注离体心脏;Katz[7]首次测定了主动脉灌注压和冠状动脉血管阻力;Luduena[8]在此基础上记录了主动脉压波型;Broadley[9]用电子记录仪测定主动脉灌注压,提高了测量的精确度。

     原理:Langendorff模型采用“主动脉逆行灌注法”,即经主动脉插管,灌注液通过冠脉系统,经右心室和肺动脉排出(图 1)。Langendorff模型虽然可给心脏提供营养物质,使心肌保持跳动,但由于实验中左心室是空虚的,心脏不能作功,因此,心肌保护的实验研究中多采用离体工作心脏模型。

图 1  Langendorff制备心脏灌流原理

    依据实验目的,可进行恒压与恒流灌流,两种灌流方式各有优缺点。在恒流灌流条件下,使用晶体溶液的灌流量较大,比在体有血液灌流的灌流量高几倍,可达到每克组织8-12 ml/min,因此灌流充分,但其缺点是灌流量不能随心率与心脏功率的变化而改变。在局部缺血模型上,因接扎冠脉分支,使未发生缺血部位的灌流量明显增加。

    使用简单的设备难以实现恒压与恒流灌流之间的转换。Shattock等使用蠕动泵建立了电反馈系统,进行恒压与恒流灌流间的相互转换,方便且快速,可实时监测灌流压力与流量,并进行按需调节[10]。这一系统在研究血管功能方面具有优越性,已成功地在兔、豚鼠、大鼠与小鼠心脏采用此方法。

实验方法

     动物的麻醉:麻醉剂有吸入性的乙醚、halothane or methoxyflurane和戊 巴比妥,后二者可经腹腔、尾与股静脉注射。不能采用颈部离断与敲击头部的方法,这样可使血中儿茶酚胺升高。二氧化碳致死法引起缺氧亦不能使用。吸入性麻醉剂对人产生刺激作用,应在通风良好的环境中使用。戊巴比妥可减少细胞内高能磷酸含量而使心血管与呼吸功能降低。因此,在进行心血管功能研究时,最好使用对心血管功能影响较小的麻醉剂。有研究表明,氯胺酮(Ketamine,Ket)与安定(Diazepam或Valium,Dia)联合使用,对心血管功能影响较小[11]。静脉注射剂量为大鼠每公斤体重Ket 7.5 mg与Dia 0.375 mg;腹腔注射剂量为大鼠每公斤体重Ket 50.0 mg与Dia 2.5 mg。在实施麻醉过程中,应尽量减少对动物的应激作用,麻醉完全生效后再进行手术(针扎脚蹼无回缩反应)。因肝素具有脂质降解作用,故在脂肪酸代谢的研究中不能使用。其他实验中,尽量使用肝素(大鼠2000 U/kg),以防止血栓的形成。

摘取心脏:麻醉生效后,先剪开腹腔,然后经膈肌于胸腔两侧剪开胸腔,止血钳夹住胸前壁,翻向头部,完全暴露出心脏,用拇与食指轻捏心脏底部(尽量避免挤压心脏),轻轻提起,剪下心脏,尽量保留较长的主动脉。将心脏迅速置室温(18-22 ℃)的清洗液中,迅速行主动脉插管,恢复冠脉灌流。大鼠或比大鼠大的动物,最好在30 s内恢复冠脉灌流,小鼠最好在3 min内恢复冠脉灌流,以防止产生缺血预适应或缺血作用[12]。文献中一般使用4 ℃的清洗液,我们实验室不推荐使用此方法。使用4 ℃清洗液的目的是降低心脏代谢以防止离体心脏发生缺氧,但是,突然的低温与随后的突然复温至37 ℃,对心肌功能会造成损伤,特别是清洗液温度低于15 ℃的条件下,损伤会更严重[13]。所以,使用与室温相同的清洗液,但对清洗液进行充分的氧合,是一个较好的解决方案。

主动脉插管:可用玻璃、塑料或不锈钢的主动脉插管,插管的外径为3.0-3.5 mm(250 g大鼠主动脉内径为3 mm),插管外应有一圈凹槽或表面打磨成粗糙面,以防止血管滑脱。插管尽量短一些或外面加保温层,防止温度变化。斜剪主动脉弓,插管时让液体慢速滴下以防气栓形成。主动脉插入插管后,不宜太深,以免损伤主动脉瓣或/阻碍冠脉灌流。用动脉夹夹住主动脉,1号丝线将主动脉结扎于插管上,结扎部位正好位于插管凹槽处。调整至正常流速或流量。恒压灌流时,设定灌流压力为100-140 mmHg。恒流灌流流速为8-12 ml/min(1 g心脏,晶体灌流液)。

    心脏开始正常灌流后,剪去周围的脂肪和肺组织。并使肺动脉回流通 畅,如需进行肺动脉插管,则插入PE10导管(测量心室肌氧耗量);如不需插管,则在肺动脉根部剪一小口。心脏流出液可收集进行分析,也可废弃。由于心脏灌流量较大,除开始灌流5 min内的流出液废弃外,可收集流出液,经5 µm孔径滤膜过滤后循环使用。

    心脏恢复灌流后,在数秒内即可恢复有规律的心脏搏动,一般在10 min后心脏功能达最大。可使用刺激器让心脏按照所需频率搏动,亦可不使用刺激器让心脏按固有频率搏动。刺激电极一个置于心脏表面,另一个置于不锈钢的主动脉插管上,采用双向方波刺激,避免单向方波引起的电解作用而造成损伤。记录心电图时,记录电极置心脏表面,参考电极置不锈钢主动脉插管上。采用该模型最重要的是检测左心室内压力的变化,以监测心功能。可采用左心室放入水囊的方法。水囊有商业化的产品,也可以自制:在PE10导管外包一层保鲜膜,用3-0丝线扎成一个小囊,囊的长度为3-5 mm,由左心房经过二尖瓣插入左心室,荷包缝合方式,沿瓣膜固定气囊(注意不损伤冠脉血管)或用橡皮泥固定,连接压力传感器,使囊内压力为4-8 mmHg,过高的压力将对组织产生挤压而引起心内膜缺血。为了保证心脏温度均一,可在心脏外面包一层保鲜膜,或浸入灌流液中。

二、工作心脏制备(Working heart preparation)

    原理:1967年,Neely[14]首次报道离体工作心脏模型,即在辅助循环装置的帮助下,经左心房插管,将灌注液经二尖瓣流入左心室,在左心室收缩时经主动脉排出(主动脉顺行灌注法),此时左心室起着压力-容量交换的作用,并且在心室舒张时使冠状动脉得到灌注(图 2)。由于工作心脏模型接近生理上的灌注方式和可靠的测定方法,现已被广泛地应用于心脏保护的实验研究中。工作心脏制备最大的优点是可改变前、后负荷,从而测定心脏泵功能。

实验方法

    建立工作心脏的第一步是建立Langendorff模式,故前面的步骤与建立Langendorff模式基本相同,不同点是不在左心室放置水囊,并将心脏的后侧转到前面,以便进行肺静脉插管。 保证工作心脏成功的关键是左心房插管,从肺静脉的一个开口插入,确保没有液体漏出。然后转动三通开关,建立工作心脏。大鼠心脏一般采用20 cmH2O前负荷,60-100 cmH2O后负荷。另外一个容易忽视的关键点是心房灌流管道的流量,一般要满足心排出量2倍的流量,即不悬挂心脏时,假定心脏质量为1 g,在20 cmH2O前负荷下,流量最大可达到150 ml/min。主动脉上方的气室用来模拟血管的弹性作用,气室注气2 ml,如果没有气室,心脏会很快衰竭。体重250 g大鼠,工作心脏的冠脉流量应达到25 ml/min,主动脉流量为50-80 ml/min。流量的测量可分别收集每分钟从主动脉与心脏流出的液体,然后用量筒测量。也可用电磁流量计测量。主动脉泵出液体经5 µm孔径滤膜过滤后循环使用。一个大鼠心脏至少需配制2 L液体,小鼠心脏需大约1 L液体。

2   工作心脏制备中液体流动的路线

    采用水夹层保持灌流液温度是常用的方法,除观测温度变化对心功能的影响外,应将灌流液温度控制在37.0-37.5°C,过高或过低均不合适。为了保证温度在循环过程中不降低,保温管道要确保通畅,另外,重要部位应离恒温泵最近,如左心房的灌流管道、心脏保温槽与主动脉灌流管道。最好在左心房与主动脉灌流管道内放置微型温度传感器,以监测温度。

 

三、保证实验成功的其他因素

1. 晶体灌流液的制备

    除进行NMR监测的溶液中不含磷酸盐外,大量文献报道使用的灌流液为Krebs- Henseleit液[15],其组成为(mmol/L): NaCl 118.5,NaHCO3 25.0,KCl 4.7,MgSO4 1.2,KH2PO4 1.2,glucose 11.0 和CaCl2 2.5,在 37ºC 时pH 7.4。这一生理溶液的问题是Ca2+浓度过高,由于血液中存在蛋白与红细胞,蛋白对Ca2+有结合作用,所以,血液中实际游离的Ca2+浓度仅为2.5 mmol/L的一半,所以,以往的研究均处于高钙灌流条件下,心功能也接近Ca2+量效关系的上限。现在,许多研究者已经纠正了这一问题,将灌流液Ca2+浓度调整为1.2~1.8 mmol/L。

    配制Krebs-Henseleit液时,为防止钙离子与磷酸根、钙离子与碳酸氢根结合形成微小颗粒而堵塞冠脉系统,一是先用95%O2 + 5%CO2氧合液体至少10 min后,再加入钙离子,加钙时,要搅拌液体;二是过滤所有液体,去除液体中存在的各种微粒。

    Krebs-Henseleit液中葡萄糖含量高达11 mmol/L,其设计思想可能是提供心脏灌流时做功所需的高能量,但是,“糖尿病”性高血糖并不能保证给心脏提供大量的能量,必须使用胰岛素。在以往研究中,罕见在灌流液中加入胰岛素的报道,这主要是胰岛素引起多方面复杂的作用,干扰实验结果。虽然在体心脏主要是利用脂肪酸获取能量,但也能利用任何一种底物有效地提供能量,另外,脂肪酸难溶于水,且在通气氧合时产生大量气泡,所以,仍用葡萄糖作为唯一的能量底物。为防止长时间灌流引起水肿,可在灌流液中加入白蛋白或其它可形成胶体渗透压的试剂。药物一般可直接加入灌流液中,有些不稳定的试剂可经心房插管或主动脉插管的侧管加入,但计算浓度时,应考虑灌流液的稀释作用。

2. 电刺激方法

    离体心脏在灌流过程中,心率会逐渐减慢。离体灌流心脏的心率一般低于在体心脏的心率,正常大鼠在体心率为350~400 次/min,而离体灌流心脏的心率为250~320 次/min。由于依据种属的不同,存在正阶梯或负阶梯现象,所以,心率的变化使得心脏泵功能在大鼠个体间的差异进一步增大。为了改善实验数据的质量,可使用外部刺激使心率保持一致。有研究者采用压力与心率的乘积来反映心功能的改变,也可部分纠正心率带来的影响。

    心房与窦房结不是由冠脉供血,而是心外血管供血,所以,离体心脏心房与窦房结的氧供、营养物质供应以及温度的控制受影响较大。可采用两种方法解决这一问题:(1)让右心房的冠脉流出液滴灌这一部位;或(2)在主动脉插管引出一个分支,专门滴灌这一部位。但后者影响对冠脉流量的计算。较容易实现的方法是将心脏浸入保温槽的灌流液中。

    建立心脏的外部电刺激是较容易的,但不推荐使用这一方法,电刺激可夺获窦房结的固有心率,不便于观测。在心律失常模型或观测影响心率的药物时,不能使用外部电刺激。在严重缺血模型的缺血期,可使用电刺激,当再灌注开始后停止电刺激,这样可尽量接近在体的条件。

    刺激电极用细针制层,针外附绝缘涂层,仅针尖处无涂层,将针尖弯成小钩,可将电极挂在心室外壁或右心室内壁,另一电极放在不绣钢的主动脉插管上。也有使用吸附式或缝合式电极的报道。刺激电压为110%~150%阈电压,但不超过5 V,刺激频率高于固有心率,刺激方波的持续波宽为0.1~1 ms。

3. 心功能生理信号采集

    在Langendorff制备,可记录左心室内压力的变化与心电图,以及在主动脉插管靠近心脏处监测灌流液温度。在恒流灌注时,可记录主动脉压力;而恒压灌流时,监测主动脉流量。另外,可将超声晶片贴在左心室外壁,测量室壁外径的收缩速度;也可将超声晶片贴于左心室内外壁,或内壁的相对侧,测量心室壁厚度或心室容积的变化。

    在工作心脏制备,除能记录Langendorff制备的所有信号外,还能记录主动脉压与流量的变化,测量心室流出液的量后,可计算心排出量的变化。用Millar导管测量左心室压力的变化,或用P-V导管同时记录左心室压力与容积的变化。可行肺动脉插管,测量流量的变化。

    计算机生理信号采集系统为资料采集、储存与分析提供了极其方便的工具。

4. 剔除标准

    进行离体心脏灌流实验必须有一个剔除标准,以保证实验结果的可靠性。但是,目前尚缺乏这样一个公认的标准。少量的报道采用心率或左心室内压的最低限度作为剔除标准,但不是十分全面。单纯用制备的可重复性作标准而忽略功能指标显然也不合适。

5. 心功能逐步降低的原因

    离体心脏灌流持续时间依赖于多种因素:动物的种属与年龄,操作者的技巧(心脏有无挤压,恢复心脏灌流的速度等),灌流液的组成,心率,使用药物的情况,心脏的前后负荷与温度的控制等。一般而言,左心室内压或心排出量的衰退速度为5-10%/小时。尽管如此,有些种属的心脏在低温下停搏保存24小时或更长时间后,心功能仍能恢复到接近初始的水平。因此,在实验中一定要设置时间对照组,以排除技术原因引起心功能衰退的影响。特别是晶体溶液灌流心脏,还应建立最适合进行心功能观测的时间窗,一般是恢复灌流后20 min至3小时。

    两种模式中心功能的衰退原因除摘取心脏时的操作不当、溶液配制错误、误加入有毒物质或出现心律失常外,另一主要原因是微颗粒与细菌的作用。防止细菌的方法有两种:所有储存溶液不含葡萄糖,在现用时加入,并过滤液体;实验完成后或长时间未使用灌流装置,认真清洗灌流管道,先用1 N盐酸浸泡至少3小时,用蒸馏水清洗3次,再用75 %酒精清洗1次,最后用大量蒸馏水清洗。不推荐在灌流液中加入抗生素。

    长时间晶体溶液灌流引起的心脏组织水肿或氧运输效率改变,也可能是离体灌流心脏心功能缓慢降低的重要原因之一。

6. 增加氧运输与防止心脏组织水肿的方法

    供氧是保障所有离体灌流器官存活的中心环节,对于心脏灌流尤显重要,因心脏耗氧量较大,心功能对供氧水平敏感。传统的供氧方法是直接用95%O2 + 5%CO2氧合液体。如果加入脂肪酸或蛋白后,产生气泡可加入去泡剂,但不推荐使用去泡剂,最好使用膜式氧合器。

    氧合的晶体灌流液虽氧气携带能力相对较低,但却具有非常高的氧分压(PO2),用95%O2 + 5%CO2气体氧合时,其为PO2 为722 mmHg。已有研究证明,这一条件可提供心脏充足的氧供:(1)使用含70% O2的气体氧合灌流液,虽然PO2 降低,但心功能未受影响;(2)静脉流出液中PO2 相对较高,表明具有氧储备;(3)使用灌流液灌流数小时,心功能没有出现大幅降低;(4)当使用变力剂作用时,心功能仍能增加且心脏未发生损伤。然而,有一点值得注意:采用此方法必须以较大的灌流量为基础。

    鉴于输血可能导致传染病的传播,因而发展使用血液代用品,特别是氟化物血红蛋白替代品,这些试剂的水溶液为乳化液,较普通晶体液具有高两倍的携氧能力[16]。虽有研究者使用血液代用品进行实验观测,但未为广泛采用。这从另一角度反应出单纯晶体溶液能满足供氧要求。在灌流速度较低的条件下,采用血液代用品较为合适。血液代用品作为一种添加剂在心脏停搏液中被使用,也用来限制心梗面积的扩大。

    在许多离体器官灌流中,血液灌流均获成功,采用血液灌流离体心脏可解决上述晶体液灌流的弊端:冠脉灌流流率可保持在正常范围,不会出现组织水肿,心脏处于与在体基本相同的条件下,但受到血液中中性白细胞的影响。由于下列原因限制了血液灌流的广泛应用:(1)需要大量的血液,数只大鼠的血液仅能用于灌流1只大鼠心脏;(2)在一些条件下,大动物的血液不能用于大鼠心脏的灌流,因为红细胞比大鼠的大,难以流过心脏的毛细血管;(3)大量的气泡导致红细胞破坏。上述问题现已被巧妙地解决,如使用同种共生模型,即用一头麻醉猪的血液灌流另一猪的离体心脏;或者使用膜式氧合器。由于这些技术的进步,血液灌流模型已快速发展并取得较大成功[17-20]

 

四、血液灌流方法

    Gamble等在1970年首先进行了离体心脏血液灌流的尝试[18]。将一只大鼠使用呼吸机通气,放在37°C潮湿的环境中,行左颈动脉与静脉插管,让颈动脉中的血液流入一个橡胶袋中,通过反馈仪器保持袋中血容量恒定,然后从橡胶袋中将血液泵入另一离体心脏的主动脉插管中,从冠脉系统流出的血液经颈静脉回到支持大鼠体内。1988年,Abraham等去掉了该制备中的蠕动泵[19]

    采用支持动物氧合血液,进行离体心脏血液灌流的方法(图 4):戊巴比妥钠麻醉(60 mg/kg,i.p.)供血大鼠(350~400 g),肝素抗凝(1000 IU/kg)。分离左侧股动脉与右侧股静脉并插管,分别作供血与血液回流之用。另取同种属大鼠一只,行Langendorff制备。用蠕动泵从供血大鼠股动脉慢慢泵出血液(不宜太快,以防供血大鼠血压突然下降),在10 min内使流速达到2~3 ml/min(被灌流心脏为1 g的条件下),经主动脉插管灌流离体心脏。冠脉流出的血液滴入下方的保温槽,与槽中的Gelofusine灌流液(琥珀酰明胶注射液,商品名佳乐施:4%琥珀酰明胶与0.9%氯化钠配制的血浆代用品)相混合,经200 µm滤膜过滤后,借助重力流入供血大鼠的股静脉。Gelofusine灌流液的容积以使供血大鼠血细胞容积降低28%~30%为准(这可以减小血液粘度,防止血液的凝固),在20 min内缓慢混合供血大鼠血液与Gelofusine灌流液,两者混合充分后,即可形成稳定的灌流。可采用前面描述的反馈系统实现恒流与恒压之间的转换。也可在左心室放入水囊,记录心室内压的变化。若进行缺血处理,则可关闭主动脉灌流,通过旁路使血液直接进入保温槽中。

    具备条件的情况下,可对供血大鼠使用呼吸机,但用面罩给予95% O2 + 5% CO2混合气体进行呼吸也能满足需求,供气的流率可根据血中PO2与PCO2决定,使两者保持在生理范围即可。在放置呼吸面罩前,为防止呼吸道堵塞,可将大鼠舌头稍稍拉出口外。监测肛温保持体温正常,在股动脉插管处(蠕动泵之前)接三通管监测血压的变化。血液中电介质的变化也可进行监测。如果灌流血液不足,可再杀1只大鼠补充血液。

    这种血液灌流方法要时刻注意供血大鼠血流动力学与血生化指标的变化,动态监测其生命体征、呼吸与黏膜的颜色,确保这些参数处于正常范围。主动脉插管上方的充气注射器起到缓冲室的作用(图 3),可缓冲心脏舒缩和蠕动泵引起的压力变化。

3   血液灌流工作心脏制备

    该制备的优点:1)与单纯晶体液灌流相比,心功能较稳定,心功能降低速率明显降低,每小时大约为5 %。2)几乎没有组织水肿发生,当左心室内舒张末期压力为4~8 mmHg时,收缩压可达到130~180 mmHg。3)冠脉灌流量保持在生理范围(2~3 ml/min),并可观察血液成分如中性白细胞对心功能的影响,用两只支持大鼠血液灌流1个心脏时,可观察中性白细胞作用或去除中性白细胞对心功能的影响。4)与晶体液灌流相同,可建立完全缺血或灌流量降低方式的全心或局部缺血模型,也可以进行生物化学、形态学、药理学与功能的测量。5)如果较好的维护供血大鼠,则可使用几小时,并可灌流数个心脏。

    这一方法潜在的缺陷是:1)被灌流心脏释放或加入的某些物质,可进入供血大鼠体内,可能产生有害的作用。另一方面,也有可能因代谢或排泄出从灌流心脏来的物质,而产生有利的作用。2) 供血大鼠任何系统功能的衰退,将威胁到灌流心脏的存活。但可小心更换新的供血大鼠来解决这一问题。3)用全血或红细胞灌流,必须确保灌流液不与玻璃器皿接触,以防发生红细胞溶血。

五、红细胞灌流技术

    Bergmann等在1979年报道了红细胞灌流技术,他们用绵羊的清洗后的红细胞,使灌流液中红细胞容积为25% 或 40%,灌流液经简单的膜式氧合器氧合后,灌流兔离体心脏[21]。这一方法使离体心脏功能稳定,不发生组织水肿。膜式氧合器相当于人工肺,由具有半透膜性质的硅胶螺旋管组成,外面是保温的水夹层,通入95%O2 + 5%CO2的混合气体,使流经硅胶管内的液体氧合。这一方法的好处是用一个蠕动泵使灌流液进入或流出膜式氧合器,因此,可使两边的流速完全相等。含红细胞的灌流液放置在存储瓶中,轻轻搅拌,确保形成红细胞悬液。灌流液经白细胞滤器后灌注心脏,白细胞滤器的作用是:1)滤膜面积大并浸在热水中,便于调节温度;2)防止微血栓(图 4)[22]

图 4  白细胞滤器

    红细胞灌流液的制备:这是一个较为费时的过程。用含5,000 IU 肝素/L 与0.2  MU/L青霉素的采血袋采集绵羊或牛血液,经200 µm滤膜过滤后,1000 g离心20 min,弃上清与白细胞层,用无钙的灌流液重悬红细胞,重复离心至上清为清亮液体为止。如当天不使用,第一次离心后,将沉淀置4ºC保存,使用时再行清洗。洗好的红细胞按所需的红细胞容积(5%~40%)加入含右旋糖苷(Dextran)与白蛋白的Krebs溶液中(mmol/L): NaCl 118.5, KCl 3.8, KH2PO4 1.2, NaHCO3 25.0, MgSO4 1.0,glucose 10.0,右旋糖苷 4%,BSA (Fraction V, Sigma) 5%。经5 µm孔径滤膜过滤后,加入CaCl2,进行电解质测量,使游离Ca2+浓度与正常血液一致。右旋糖苷可防止微凝血形成,加入庆大霉素(2 mg/L)以延缓细菌生长。

    优点与缺点: 此方法的优点与血液灌流方法中的1至3点相似,但心室内压与晶体灌流液灌流心脏一致。该方法存在不良免疫反应的可能性,但经清洗除去了白细胞与血浆,减小出现明显免疫反应的可能性。然而,进行性红细胞破坏不可避免,因此,在红细胞制备与灌流过程中,要尽量避免与玻璃器皿接触而加速红细胞溶血。

五、离体心脏缺血模型

    无论是采用晶体灌流液、含红细胞灌流液,还是血液对两种离体心脏制备进行灌流,许多研究者已开展了大量的全心与局部缺血研究。这两种离体心脏制备是最适合进行这样研究的模型,当缺血后出现心衰或心律失常后,均可继续实验(在体条件下必须终止实验)。全心缺血非常容易实施,关闭Langendorff制备的主动脉灌流或工作心脏的左心房灌流,即可产生全心缺血。不同程度的缺血可在Langendorff制备上实现,工作心脏制备上则不能实施,可先将工作心脏暂时转换成Langendorff制备,然后实施。恒流灌流时可逐步降低灌流流量,恒压灌流时降低灌流压力。心脏局部缺血采用冠脉结扎实现,一般结扎左冠脉的主干。为了防止丝线在结扎时撕脱和缺血后易于松开结扎,可在结扎线上套一短的塑料管。冠脉结扎后心肌梗死的面积由结扎的部位决定,大鼠冠脉系统较为均一,所以在同一部位结扎后,大鼠个体间心肌梗死面积变异较小。心肌梗死的范围还可依据冠脉灌流流速降低的百分比(恒流灌流条件下)或冠脉阻力增加的百分比(恒压灌流时)来作出估计。在再灌注的初期灌注染料或荧光微粒可较精确地测量心肌梗死面积。在Langendorff制备上使用一种新的双管式插管[23],可对左、右冠脉进行分开灌流,这种新工具在观察药物的局部作用中非常有用,也可实行局部的低流量缺血。另外,离体心脏还能观察局部或全心低氧与复氧的影响。

    总之,两种心脏制备虽为心血管研究提供了有价值的模型,但均存在优缺点,因此,我们必须在对它们有全面理解的基础上,经反复实践摸索,根据研究目的,尽可能地达到最佳效果。

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